利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）篩選產(chǎn)生雜交瘤的單克隆抗體（mAb）耗時(shí)且昂貴。生物傳感和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合代表了一種有前途的快速、高通量的篩選mAb克隆的方法?；谘趸℅O）和含有硒蛋白K （SELENOK）抗原表位N-端部分的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記肽的組裝，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的氧化石墨烯熒光生物傳感器，用于篩選高親和力單抗產(chǎn)生的雜交瘤。FITC標(biāo)記的肽被強(qiáng)吸附在氧化石墨烯表面，有效地淬滅了FITC熒光。特異的SELENOK mAb與FITC-肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致FITC-肽從氧化石墨烯表面釋放，熒光恢復(fù)。該傳感器成功地用于檢測(cè)SELENOK mAb，其檢測(cè)限為0.25 U。此外，我們還利用該FITC-Peptide/GO生物傳感器在單細(xì)胞水平上進(jìn)行原位可視化和高通量篩選SELENOK mAb雜交瘤（SMAHs）。所提出的傳感器簡(jiǎn)單，相對(duì)便宜，高度特異性，適用于細(xì)胞分選試驗(yàn)，并且證明了在其他單抗雜交瘤庫(kù)的特異性篩選中，肽-抗體相互作用的有效使用。
流程圖1. 基于FITC-肽/GO復(fù)合物的SELENOK mAb檢測(cè)和mAb雜交瘤篩選的示意圖。
圖1. 基于FITC-肽/GO復(fù)合物檢測(cè)SELENOK mAb可行性。樣品的熒光發(fā)射光譜(A)和紫外-可見(jiàn)吸收光譜(B)。
圖2. 反應(yīng)物濃度對(duì)檢測(cè)性能的影響。(A)在不同濃度的GO和FITC肽存在下，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。(B)FITC肽的熒光變化與GO濃度的關(guān)系。我們將添加GO后GO和FITC-肽復(fù)合物的熒光強(qiáng)度定義為F，然后，在存在SELENOK mAb的情況下，SELENOK/FITC-肽復(fù)合物的熒光強(qiáng)度定義為F1。
圖3. SELENOK mAb檢測(cè)條件的優(yōu)化。測(cè)試了時(shí)間進(jìn)程(A-B)、緩沖液(C-D)和pH范圍(E-F ),以確定基于熒光實(shí)驗(yàn)的最佳條件。
圖4. SELENOK mAb含量的熒光檢測(cè)。(A)顯示了不同濃度的SELENOK mAb的熒光信號(hào)響應(yīng)。(B)確定了熒光增強(qiáng)和不同濃度的SELENOK mAb之間的關(guān)系。插圖顯示了分析對(duì)較低SELENOK mAb量的響應(yīng)。
圖5. SELENOK mAb的選擇性。用各種物質(zhì)處理后增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(ΔF):甘氨酸(0.2 mM)、谷氨酰胺(1 mM)、CaCl
2 (0.5 mM)、KCl (1 mM)、葡萄糖(10 mM)、BSA (2.5 μg/mL)、FBS (2.5 μg/mL)、β-肌動(dòng)蛋白 mAb(2.5 μg/mL)、SELENOK mAb(20 U)。
圖6. SMAH細(xì)胞成像。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的共聚焦激光熒光圖像包括(A) SMAH細(xì)胞和(B)與28μM FITC肽孵育2小時(shí)的RPMI-8226細(xì)胞。(C) SMAH細(xì)胞用1 mM肽預(yù)處理1小時(shí)，然后與28μM FITC肽孵育另外2小時(shí)。(D) SMAH細(xì)胞和(E) RPMI-8226細(xì)胞在與28μM FITC肽孵育2小時(shí)后用GO處理10分鐘。(F)不同條件下熒光強(qiáng)度的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示類似的結(jié)果。
圖7. 篩選產(chǎn)生高親和力mAb的雜交瘤。(A)用于分離具有不同熒光強(qiáng)度的群體的分選細(xì)胞的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。(B)通過(guò)ELISA檢測(cè)的在細(xì)胞上清液中制備的SELENOK mAb的OD450值。對(duì)細(xì)胞上清液的蛋白質(zhì)印跡(C)和光密度分析(D)進(jìn)行了SELENOK mAb水平的分析。
相關(guān)研究成果由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系Jingru Wang等人于2024年發(fā)表在Sensors and Actuators: B. Chemical (https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135575 )上。原文：Screening high affinity monoclonal antibody producing hybridomas using a graphene oxide-based fluorescence biosensor
轉(zhuǎn)自《石墨烯研究》公眾號(hào)
